Диссертационная работа

Материалы и методы

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Методы нанесения модифицированного покрытия на поверхность титановых дисков.

Особое значение при конструировании дентальных имплантатов придается их поверхности, которая во многом определяет не только прочностные свойства имплантата, но и условия для адсорбции биомолекул и адгезии клеток окружающих имплантат тканей. Кроме того, форма и структура поверхности внутрикостной части имплантата существенно влияют на способность к согласованному взаимодействию биомеханической системы «ортопедическая конструкция, - имплантат - костная ткань».

Поэтому основными задачами производства дентальных имплантатов являются:

увеличение индекса биофункциональности материала имплантата;

создание микроструктуры поверхностей имплантата, адекватной типу окружающих тканей;

создание макроконструкции имплантата, имеющей достаточную удельную площадь поверхности для адекватного биомеханического взаимодействия с костной тканью.

2.1.1 Нанесения дробеструйного покрытия на поверхность титановых дисков.

Термомеханический (воздушно-пескоструйный) метод, основан на взаимодействии потока твердых микрочастиц (окислы алюминия или кремния с характерным размером 10-30 мкм) с металлической поверхностью, микротвердость которой должна быть снижена предварительным высокотемпературным отжигом (для хромистых сплавов T~950С).

После механической обработки или отливки с поверхности заготовок механическим путем (используются специальные металлические щетки) удаляются частицы материала отливочной формы, стружки или шлаки. Затем проводится более тонкая пескоструйная зачистка поверхности, предназначенная для удаления примесей оставшихся после очистки 1-ой ступени.

Третья ступень обработки заключается в пескоструйной обработке для создания шероховатости поверхности. В качестве абразивного материала обычно используются порошки алюмоксидной или титаноксидной керамики. Оптимальным считается создание микрорельефа при обработке частицами диаметром 75 мкм. При такой обработке на поверхности металла формируется микрорельеф с характерной высотой микровыступов ~ 2-4 мкм.

Заключительным этапом термомеханической технологии является химическая очистка и обезжиривание поверхности.

Для получения необходимой поверхности на титановых образцах нами применялся второй способ – абразивная обработка с использованием керамического порошка. Данная обработка была проведена на предприятии ЗАО «КОНМЕТ» специализирующееся на производстве медицинских устройств, инструментов и имплантатов.

Для проведения исследования и изготовления образцов был выбран сплав титана марки ВТ-I-О. Образцы были выполнены в виде титановых дисков диаметром 12,0 мм, толщиной 0,5 мм, в центре которых имелось технологическое отверстие диаметром 2,5 мм. Общее количество образцов подвергшихся дробеструйной обработке составляло 80 шт.

2.1.2 Нанесения покрытия на поверхность титановых дисков с помощью ионно-плазменного травления.

Все исследования связанные с отработкой методик и созданием модифицированной поверхности титановых образцов были выполнены в Санкт-Петербургском государственном электротехническом университете «ЛЭТИ». Под руководством д.т.н. профессора, заслуженного деятеля науки и техники, лауреата Государственной премии РФ, зав. кафедрой электронных приборов и устройств Быстрова Ю.А.

Разработан принципиально новый метод создания микрорельефа на поверхности титановых образцов, основанный на технологии ионного травления.

Поверхность титанового образца обрабатывается концентрированными потоками энергии (Ионным Пучком). Метод реализован на установке УВНИПА 1-002. Модернизированный источник ионов типа «Радикал» позволяет создать на поверхности титана однородный микрорельеф с размером шероховатостей порядка 1,5-2 мкм (I разр. =1 А, исмещ.=1>5 кВ, t = 120 мин, Р раб = 4,5х102 Па, рабочий газ - аргон, реактивный газ - кислород). Модернизированная установка УВНИПА 1-002 предназначена для травления металлов и износостойких покрытий.

Для проведения исследования по ионно-плазменному травлению поверхности были изготовлены образцы из сплава титана марки ВТ-I-О. Образцы были выполнены в виде титановых дисков диаметром 12,0 мм, толщиной 0,5 мм, в центре которых имелось технологическое отверстие диаметром 2,5 мм. Общее количество образцов подвергшихся ионно-плазменному травлению составляло 80 шт.

2.1.3 Нанесения покрытия на поверхность титановых дисков с помощью микроплазменных разрядов.

Микроплазменные разряды, возбуждаемые плазмой на различных металлах, изучались давно. Учеными исследовались микроплазменные разряды, возбуждаемые на тугоплавких металлах и электропроводящем графите при их контакте с горячей плазмой, удерживаемой в установке типа токамак. Российскими учеными была показана возможность возбуждения микроплазменных разрядов на поверхности металлов в плазме, создаваемой коротким импульсом (длительностью 10 микросекунд) и мощного (мощность до 1МВт) сверхвысокочастотного излучения. Были получены уникальные результаты по возбуждению микроплазменных разрядов на поверхности металлов при их взаимодействии с потоком плазмы, создаваемым импульсным электрическим разрядом с энергией менее 1 Дж.

Данное исследование проводилось в ЗАО Научно-технологический центр ПЛАЗМАИОФАН, под руководством заведующий лабораторией плазменных процессов института общей физики РАН имени А.М. Прохорова кандидата физико-математических наук Иванова В.А.

Рис. № 4. Схема экспериментальной установки «Сфера-2»:

Рис. № 5. Изображение плазменного разряда внутри камеры.

На рис № 4.представлена схема установки «Сфера-2»: 1  вакуумная камера, 2  плазменный инжектор, 3  металлический образец, 4  оптическое окно, 5  длиннофокусный объектив, 6  цифровой фотоаппарат или система IMACON-468.

Для проведения исследования по нанесению на поверхность покрытия с помощью микроплазменных разрядов были изготовлены образцы из сплава титана марки ВТ-I-О. Образцы были выполнены в виде титановых дисков диаметром 12,0 мм, толщиной 0,5 мм, в центре которых имелось технологическое отверстие диаметром 2,5 мм. Общее количество образцов подвергшихся воздействию микроплазменных разрядовсоставляло 80 шт.

2.2. Выделение и размножение остеогенных стромальных клеток–предшественников костного мозга в монослойных культурах.

Предложенные и разработанные новые виды рельефа внутрикостной части имплантата требовали изучения эффективности колониеобразования и пролиферативной активности на этих поверхностях остеогенных клеток-предшественников.

Изучение влияния модифицированного покрытия на остеогенные клетки-предшественники, принимающие активное участие в процессе остеоинтеграции (остеорепарации) в области установленных имплантатов было проведено на модели избирательного клонирования остеогенных стромальных клеток-предшественников в лаборатории стромальной регуляции иммунитета ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (руководитель лаборатории д.м.н. Чайлахян Р.К.). Разработанная в лаборатории экспериментальная модель позволила впервые выявить в кроветворных и лимфоидных органах человека и млекопитающих новую категорию клеток, а именно, клоногенные стромальные клетки - предшественники.

При эксплантации взвеси клеток кроветворных или лимфойдных органов в монослойные культуры на 10-12 день в них вырастают видимые невооружённым глазом дискретные колонии фибробластов. После обработки трепсином они легко снимаются с пластика и поддаются многократному пассированию, образуя диплоидные штаммы стромальных клеток-предшественников.

Реакцию остеогенных клеток-предшественников на модифицированную поверхность изучали как на первичных культурах, определяя эффективность колониеобразования, т.е. отношение числа вырастающих колоний к стандартному числу эксплантированных клеток, так и на диплоидных штаммах этих клеток, исследуя воздействие на пролиферативную активность остеогенных клеток–предшественников в культурах.

Эксперименты проведены на 30 крысах «Wistar» самцах массой 80-100 г, полученных из питомника экспериментальных животных РАМН «Крюково».

Получение эксплантационного материала и приготовление суспензий.

Крыс усыпляли эфиром. С соблюдением правил асептики, через разрез на задней части бедра выделяли бедренные и большеберцовые кости. Эпифизы костей обрезали и шприцом выдували костный мозг во флакон с питательной средой. Фрагменты костного мозга пропускали через шприц с последовательно уменьшающимся диаметром игл, при минимальном давлении в нём, до получения гомогенной взвеси клеток. Взвесь дважды отмывали центрифугированием при 4ОС (400g), осадок ресуспендировали в свежей питательной среде, фильтровали через 4-х слойный капроновый фильтр и подсчитывали число клеток к камере Горяева.

Жизнеспособность клеток в суспензиях определяли по окраске 0,1% раствором трипанового синего. Каплю красителя добавляли к капле суспензии, тщательно перемешивали, заполняли камеру Горяева, и черед 1-2 минуты производили подсчёт живых и мёртвых клеток.

Эксплантация клеток. Для определения эффективности колониеобразования стромальных клеток-предшественников одинаковое количество костномозговых клеток исследуемой суспензии помещали в культуральные 6–ти луночные планшеты с площадью 9,6 см.2 каждый, с 4 мл питательной среды. Плотность эксплантации составляла 3,6х104 клеток/см.2, то есть в каждую лунку засевали по 3,5х105 клеток костного мозга крыс.

Для получения штаммов стромальных клеток-предшественников 3х106 клеток костного мозга эксплантировали во флаконы площадью дна 75 см2. На 10-14 день культивирования, когда колонии стромальных фибробластов были полностью сформированы проводили I пассаж.

Культуральная среда состояла из 80% среды  - МЕМ, 20% сыворотки эмбрионов коров, и антибиотиков - 100 ед. пенициллина и 100 мг стрептомицина на 1мл. среды. Культивирование проводили в СО2 инкубаторе при 37ОС.

Пассирование клеток. Первичные культуры, выращенные во флаконах, дважды отмывали от сыворотки физиологическим раствором. Затем флаконы добавляли 2-3 мл. 0,25% раствора трипсина, которым обрабатывали культуры в течение 3-5 мин, затем флаконы переворачивали и в таком виде помещали в термостат при 37ОС. Через 15-20 минут трипсин сливали, в культуральные флаконы добавляли, свежую питательную среду, и несколько раз встряхивали их. Не открепившиеся клетки снимали пипетированием. Подсчёт числа снятых клеток производили в камере Горяева. Необходимое количество клеток переносили во флаконы с большей площадью дна. Повторные пассажи проводили по этой же методике по достижении полного монослоя клеток в культурах. Питательная среда в пассируемых культурах состояла из 30% кондиционированной среды, и 70% свежей полной питательной среды.

Для изучения действия модифицированной поверхности на пролиферативную активность штаммов остеогенных клеток-предшественников в 6-ти луночные планшеты помещали титановые диски, с разной поверхностной обработкой, и засевали одинаковое количество пассированных клеток. Культивирование проводили в течение 5-7 дней до формирования плотного монослоя клеток. По описанной выше методике клетки снимали с пластика и производили подсчёт в камере Горяева.

Фиксация, окраска и подсчёт колоний. Перед фиксацией культуральную среду из планшетов сливали, планшеты несколько раз промывали физиологическим раствором и на 30 мин. заливали 80% этанолом. Фиксированные культуры окрашивали по Гимза. Число выросших колоний подсчитывали под бинокулярной лупой, учитывая при этом все колонии состоящие из 50 и более остеогенных фибробластов.

2.2.1. Влияние титановых дисков с различной обработкой поверхности на остеогенные стромальные клетки - предшественники костного мозга в культуре тканей invitro.

Влияние модифицированной поверхности на остеогенные стромальные клетки-предшественники костного мозга участвующие в процессе остеоинтеграции, проходящие в костной ткани при имплантации, изучали на модели избирательного клонирования в первичных монослойных культурах костного мозга и штаммах остеогенных стромальных клеток.

Для сравнения обработки поверхности был выбран титан марки ВТ-I-О. Образцы представляли собой титановые диски диаметром 12,0 мм, толщиной 0,5 мм, в центре которых имелось технологическое отверстие диаметром 2,5 мм. Первая группа дисков была обработана дробеструйным способом, вторая группа - ионно-плазменным, а третья с помощью микроплазменных разрядов. По 72 диска в каждой группе. После необходимой подготовки все диски были подвергнуты стерилизации.

В 6-ти луночные планшеты поместили титановые диски, обработанные различными способами. В каждую лунку засевали 3х105 костномозговых клеток в 4 мл полной культуральной среды. По числу выросших колоний при равном количестве клеток эксплантированных в лунку определяли влияние помещённых в культуру дисков на эффективность колониеобразования. Влияние титановых дисков с разной поверхностной обработкой, на пролиферативную активность остеогенных клеток-предшественников изучали, засевая лунки с помещёнными в них дисками, одинаковым количеством остеогенных стромальных клеток-предшественников II и III пассажа. В каждую лунку засевали по 3х104 клеток в 4 мл. культуральной среды. На 4-ый день культивирования, когда в лунках формировался плотный монослой клеток, культивирование прекращали. Культуры промывали и после обработки 0,25% раствором трепсина снимали с пластика. В камере Горяева подсчитывали общее число клеток, выращенных в каждой лунке.

В каждой серии опытов на каждый вид испытуемых дисков засевали по три 6-ти луночных планшета.

I - группа планшетов с дробеструйно-обработанными титановыми дисками.

II - группа планшетов с титановыми дисками обработанными ионно-плазменным способом.

III – группа планшетов с титановыми дисками обработанными с помощью микроплазменных разрядов.

IV - контрольная группа, без титановых дисков, которую составляли планшеты с тем же числом эксплантированных клеток.

2.3. Проведение сканирующей электронной микроскопии подготовленных титановых образцов.

Проведение сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) позволило определить рельеф поверхности, её выраженность, агрессивность неровностей и чистоту. Данное исследование проводилось также для определения степени и площади адгезии культуры тканей остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга на поверхности исследуемых титановых образцов с разной поверхностной обработкой.

Электронная микроскопия позволила визуально определить форму и количество клеток, оценить степень прикрепления клеток к поверхности титановых дисков с разной обработкой поверхности.

Данное исследование проводилось в межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биофака МГУ им. М.В.Ломоносова.

Рис. № 6. Установка для подготовки к сканирующей микроскопии.

Рис. № 7. Установка для сканирующей микроскопии.

2.3.1. Подготовка титановых образцов с выращенным на их поверхности костномозговыми стромальными клетками к электронному сканирующему микрокопированию.

Культуру ткани на титановых дисках перед фиксацией трижды отмывали раствором Хэнкса при температуре 37ОС. После чего готовили специальный раствор, для культуры состоящий из: (1,6 мл 25 % глютаральдегида, 15 мл какодилата Na (0,2 Моль), 3,4 мл Н2О) в котором, не менее 1 часа находились титановые диски в условиях термостата при 37ОС. Далее осуществлялась проводка (обезвоживание) состоящая из несколько этапов, с применением чистого ацетона с увеличивающейся, до максимальной концентрации. Подготовленные препараты подвергались электронному сканированию в течение 1 часа.

Для электронного сканирования были выбраны по 10 титановых образцов с клеточным материалом после II и III пассажа, из трёх исследуемых групп с различной поверхностной обработкой.

2.4. Определение площади заселения клеточного материала на титановых образцах различных групп при сканирующей электронной микроскопии.

Все полученные изображения после электронного сканирования титановых образцов с различной обработкой и наличием на исследуемой поверхности клеточного материала после II и III пассажа были подвергнуты специальной обработке с помощью ряда компьютерных программ.

Это было сделано для определения и сравнения соотношения площадей, занятых клетками предшественниками костного мозга в трёх группах исследуемых образцов. Для этого использовались:

векторный графический редактор: выделение, заливка области, занятой клетками (на новом слое). Сохранение в формате jpg и psd.

3Д редактор: создание плоскости, пропорциями идентичной файлу jpg , состоящей из 32768 полигонов(128х128х2). Проекция на плоскость файла jpg в качестве текстуры. Преобразование плоскости в Edit Mesh. Выделение полигонов, соответствующих заливке клеток. Вычисление занятой выделением площади (N – количество выделенных полигонов) в процентах = N/32768*100.

В дальнейшем применялось математическое компьютерное моделирование, определение и расчёт площади занимаемых клеточным материалом, определение процентного соотношения по исследуемым группам образцов.

Рис. № 8. Внешний вид математической модели при сканировании поверхности образца.

Рис. № 9. Поверхность образца с увеличением отдельного сегмента.

Полученный цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики с вычислением средних арифметических величин (М), среднеквадратичное отклонение () и среднеквадратичной (стандартной) ошибки (m) (Бейсман В.М. 2002).

Критерий достоверности оценивали по таблице Стьюдента. Статистически достоверными считали величины, которым в таблице соответствовали значения p < 0,05, p < 0,01 значимыми считали вероятности большими 95%, 99% (Сергиенко В.И., Бондарева И.Б 2001).

Для расчётов и оформления работы использовали персональный компьютер с операционной системой Windows XP, прикладные программы MS Word, MS Excel.