Диссертационная работа

Заключение, Обсуждение,

Обсуждение полученных результатов исследований.

Одной из важнейших проблем современной дентальной имплантологии остаётся профилактика и лечение воспалительных процессов, уровень которых продолжает оставаться достаточно высоким. Частота воспалительных осложнений после операции колеблется от 5 до 10%, что отрицательно влияет на течение послеоперационного периода и увеличивает вероятность отторжения имплантата. Строгое соблюдение правил операционной техники, предупреждающей механические погрешности во время оперативного вмешательства, безусловно, является залогом дальнейшего успеха. Важной проблемой в послеоперационном периоде остаётся профилактика нарушений местного кровообращения в области проведения операции. Но основной проблемой при дентальной имплантации есть и остаётся остеорепарация и попытка активизировать или, по крайней мере, оптимизировать этот процесс.

Начало процессов заживления, наступает вслед за операционной травмой при проведении дентальной имплантации. Этот процесс в основном сопоставим с тем, который имеет место при срастании переломов челюстных костей. Важнейшей предпосылкой удачной операции дентальной имплантации является состояние кровообращения в области предполагаемого вмешательства.

В местах, обладающих хорошим кровоснабжением, таких как надкостница и другие мягкие ткани, повреждение сосудов компенсируется образованием коллатерального кровообращения. В противоположность этому, в губчатом и, особенно, в компактном веществе костной ткани такого замещения после травмы не наблюдается. Уровень ограничения кровоснабжения влияет как на регенерацию тканей вокруг имплантата, так и на сроки и объем заживления.

Прогноз характера сосудистой реакции на операционную травму и влияние на динамику восстановления кровоснабжения в послеоперационном периоде ведёт к гарантированной регенерации, и как следствие к остеинтеграции.

В результате многочисленных исследований, было установлено, что определенная модификация поверхности дентального имплантата, например, увеличение толщины оксидной пленки или придание шероховатости поверхности, может оказывать благоприятное влияние на процесс остеогенеза.

Шероховатая поверхность титановых сплавов обладает большей поверхностной энергией и смачиваемостью, что способствует адсорбции белков, механическому прикреплению к поверхности материала волокон фибрина и коллагена. Наличие определенной шероховатости, пор или углублений на поверхности внутрикостной части имплантата способствует адгезии остеогенных клеток, фибро - и остеобластов, синтезу специфических белков и факторов роста, что в конечном итоге позволяет достичь увеличения площади костной интеграции.

Поиску новых, оригинальных методов получения микрорельефа на внутрикостной части дентального имплантата и проведению их сравнительной характеристики посвящена данная работа.

Работа состояла из экспериментальной и лабораторной части.

В первой части эксперимента проведены исследования связанные с отработкой методик и созданием модифицированной поверхности титановых образцов. Они выполнены на кафедре электронных приборов и устройств в Санкт-Петербургском государственном электротехническом университете «ЛЭТИ». Под руководством д.т.н. профессора, заслуженного деятеля науки и техники, лауреата Государственной премии РФ Быстрова Ю.А.

Разработан принципиально новый метод создания микрорельефа на поверхности титановых образцов, основанный на технологии ионного травления.

Поверхность титанового образца обрабатывается концентрированными потоками энергии (Ионным Пучком). Метод реализован на установке УВНИПА 1-002. Модернизированный источников ионов типа «Радикал» позволяет создать на поверхности титана однородный микрорельеф с размером шероховатостей порядка 1,5-2 мкм. Модернизированная установка УВНИПА 1-002 предназначена для травления металлов и износостойких покрытий.

Для проведения исследования по ионно-плазменному травлению поверхности были изготовлены образцы из сплава титана марки ВТ-I-О. Образцы были выполнены в виде титановых дисков диаметром 12,0 мм, толщиной 0,5 мм, в центре которых имелось технологическое отверстие диаметром 2,5 мм. Общее количество образцов подвергшихся ионно-плазменному травлению составляло 80 шт.

Второй разновидностью, выбранной поверхности, стала поверхность получаемая с помощью микроплазменных разрядов.

Микроплазменные разряды, возбуждаемые плазмой на различных металлах, изучались давно. Учеными исследовались микроплазменные разряды, возбуждаемые на тугоплавких металлах и электропроводящем графите при их контакте с горячей плазмой, удерживаемой в установке типа токамак. Были получены уникальные результаты по возбуждению микроплазменных разрядов на поверхности металлов при их взаимодействии с потоком плазмы, создаваемым импульсным электрическим разрядом с энергией менее 1 Дж.

Данное исследование проводилось в ЗАО Научно-технологический центр ПЛАЗМАИОФАН, под руководством заведующий лабораторией плазменных процессов института общей физики РАН имени А.М. Прохорова кандидата физико-математических наук Иванова В.А.

Общее количество образцов, их размер и форма в этой группе было идентичным предыдущей.

Для сравнения двух новых поверхностей была выбрана классическая форма поверхностной обработки титановых сплавов дробеструйная.

Суть метода заключается в пескоструйной обработке для создания шероховатости поверхности. В качестве абразивного материала обычно используются порошки алюмоксидной или титаноксидной керамики, частицами диаметром 75 мкм. При такой обработке на поверхности металла формируется микрорельеф с характерной высотой микровыступов ~ 2-4 мкм.

Подготовленные образцы были идентичны предыдущим.

Предложенные и разработанные новые виды рельефа внутрикостной части имплантата требовали изучения взаимодействия этих поверхностей с остеогенными клетками предшественниками.

Изучение влияния модифицированного покрытия на эти клетки, принимающие активное участие в процессе остеоинтеграции (остеорепарации) в области установленных имплантатов было проведено на модели избирательного клонирования остеогенных клеток-предшественников в лаборатории стромальной регуляции иммунитета ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (руководитель лаборатории д.м.н. Чайлахян Р.К.).

Первая группа дисков была обработана дробеструйным способом, вторая группа - ионно-плазменным, а третья с помощью микроплазменных разрядов. По 72 диска в каждой группе. После необходимой подготовки все диски были подвергнуты стерилизации.

Изучение влияния титановых дисков на колониеобразование остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга и пролиферативную активность стромальных клеток при развитии штаммов проводили, помещая их в пластиковые 6-ти луночные флаконы с питательной средой, вслед за эксплантацией костномозговых остеогенных стромальных клеток. Титановые диски (по 36 образцов в каждой группе), находились в лунках в течение всего времени культивирования.

Оценивая результаты исследований по влиянию титановых дисков с различной обработкой поверхности на колониеобразование остеогенных стромальных клеток-предшественников в монослойных культурах. Во 2-ой группе культур (ионно-плазменная обработка поверхности) число выросших колоний было достоверно больше, чем в контрольной группе (21,11 ± 0,36). В 1-ой группе, где в планшете были помещены титановые диски с дробеструйной обработкой поверхности, число выросших колоний (20,22 ± 0,50) было так же достоверно выше (Р < 0,05) контрольных значений.

Если количество выросших колоний фибробластоподобных клеток в контрольной группе образцов принять за 100%, то увеличение прослеживается в двух экспериментальных группах из трёх. В группе с ионно-плазменным травлением 112,5%, с дробеструйной обработкой поверхности 107,7%. В группе с обработкой микроплазменными разрядами незначительное уменьшение 95,9%.

Необходимо отметить, что в 3-й группе, в которой находились титановые диски с поверхностью полученной с помощью микроплазменных разрядов, среднее число колоний было достоверно ниже не только контрольной группы, но и двух первых экспериментальных групп (18,0 ±0,29) и (18,77±0,79) соответственно.

В экспериментах с культурами клеток остеогенных клеток-предшественников II пассажа были использованы диски тех же 3 типов поверхностной обработки (по 36 образцов в каждой группе).

Как и в экспериментах, по изучению влияния титановых дисков с различной поверхностной обработкой на эффективность колониеобразования среднее число выросших клеток было достоверно больше в культурах, в которые находились титановые диски после ионно-плазменной и дробеструйной обработки поверхности (2,01 ± 0,02) и (1,88 ± 0,03) соответственно. Достоверно меньшее число выросших клеток было в группе с титановыми дисками после обработки поверхности микроплазменными разрядами (1,7 ± 0,22), как по сравнению с первой и второй группами, так и с контрольной группой культур без титановых дисков (1,36 ± 0,07) (Р < 0,05).

Если количество выросших фибробластоподобных клеток в контрольной группе образцов принять за 100%, то увеличение прослеживается во всех экспериментальных группах. В группе с ионно-плазменным травлением 147,8%, с дробеструйной обработкой поверхности 138,2%, в группе с обработкой микроплазменными разрядами 125%.

Не столь значительную разницу в увеличении числа клеток в культурах с разным микрорельефом титановых дисков и контрольной группой можно объяснить быстрым (3-4 дня) формированием в них плотного монослоя остеогенных фибробластоподобных клеток. Дальнейшую пролиферацию остеогенных фибробластов ограничивает развивающееся контактное торможение клеток. В то же время более равномерное развитие культур контрольной группы в первые дни, к 7 дню, возможно, достигло пика пролиферативной активности.

Обобщая полученные результаты можно с уверенностью сказать, что предложенные нами различные варианты обработки поверхности титановых дисков, за исключением поверхности полученной с помощью микроплазменных разрядов не только не угнетают формирование колоний остеогенных клеток-предшественников костного мозга и их пролиферативную активность in vitro, но оказывают незначительный стимулирующий эффект.

Ставя перед собой задачу, визуально оценить степень и площадь прикрепления фибробластоподобных остеогенных клеток-предшественников к различным поверхностям имеющихся образцов мы прибегли к СЭМ титановых дисков используемых в предыдущем эксперименте со штаммами стромальных клеток предшественников. Данное исследование проводилось в межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биофака МГУ им. М.В.Ломоносова.

При завершении эксперимента по изучению влияния титановых дисков с различными видами обработки на пролиферативную активность стромальных клеток предшественников диски аккуратно извлекали из лунок и подвергали специальной обработке для проведения сканирующей электронной микроскопии поверхности.

При проведении электронного микроскопирования поверхности, титановых дисков обработанных ионно-плазменным способом, отчётливо определялись фибробластоподобные клеточные структуры «распластанные» на поверхности металла, с выростами эктоплазмы клеток фиксированных на имеющихся неровностях. В большинстве своём, определяются участки поверхности титанового диска с множественными выростами эктоплазмы фибробластоподобных клеток предшественников.

В группе титановых дисков с поверхностью обработанной дробеструйным способом, под увеличением 3 мкм определяются фибробластоподобные стромальные клетки на поверхности металла, с выростами эктоплазмы. Между клеточных структур прослеживается микрорельеф поверхности.

При исследовании участков поверхности, титановых дисков обработанных с помощью микроплазменных разрядов визуально определялись единично расположенные фибробластоподобные остеогенные клеточные структуры «распластанные» на поверхности металла, с выростами эктоплазмы клеток фиксированных на имеющихся неровностях.

Для электронного сканирования поверхности и последующего определения площади занятой клетками были выбраны по 10 титановых образцов из трёх исследуемых групп с различной поверхностной обработкой.

Все полученные изображения, после электронного сканирования титановых образцов и наличием на исследуемом микрорельефе клеточного материала были подвергнуты специальной обработке с помощью ряда компьютерных программ.

Это было сделано для определения и последующего сравнения соотношения площадей, занятых стромальными клетками-предшественниками костного мозга в трёх группах исследуемых образцов. Сравнение показателей проводилось между группами с различной поверхностной обработкой.

В дальнейшем применялось математическое компьютерное моделирование, определение и расчёт площади занимаемых клеточным материалом, определение процентного соотношения по исследуемым группам образцов.

Оценивая результаты исследования можно сделать вывод, что величина площади занимаемой клетками на поверхности титановых образцов прошедших обработку с помощью ионно-плазменного травления равна 73,5% от всей площади свободной поверхности. Это достоверно больше величины свободной площади титанового диска 26,4%.

Анализируя полученные данные можно сказать, что величина площади занимаемой клетками на дробеструйно-обработанной поверхности титановых образцов равна 58,5% от общей площади поверхности. Это немногим больше половины величины свободной площади титанового диска 41,5%.

Величина площади занимаемой клетками на поверхности титановых образцов прошедших обработку с помощью микроплазменных разрядов равна 23,9%, что составляет меньше четверти от общей площади диска. Соответственно величина свободной от клеток площади титанового диска составляет 72,1% его поверхности.

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что проведённая сканирующая электронная микроскопия, титановых дисков с разной обработкой поверхности, подтвердила наши данные о хорошей адгезии и значительной площади занятой пролифилирующими остеогенными стромальными клетками предшественниками костного мозга на поверхности титана. Результаты проведённого сравнительного анализа выявили, что лучшие показатели по занимаемой клетками площади продемонстрировали диски отработанные ионно-плазменным травлением (73,5%) и дробеструйной обработки (58,5%). Значительно меньшую площадь занимают клетки на титановых образцах, поверхность которых обработана с помощью микроплазменных разрядов 23,9%.

Резюмируя, можно сказать, что разработанная технология получения модифицированного микрорельефа внутрикостной поверхности имплантата с помощью ионно-плазменного травления является новаторской и прогрессивной с учётом описанных ранее свойств, полностью соответствует требованиям предъявляемым этим изделиям.

Создав новую поверхность, мы решили сразу несколько задач. Во-первых, из производственного цикла исключена механическая и дробеструйная обработка внутрикостной поверхности титанового сплава, что позволяет получить, во-вторых, чистую поверхность, внутрикостной части дентального имплантата. Помимо решения чисто технических проблем, позволяющих успешно использовать подобные имплантаты в клинике, их производство экономически выгодно, и способно приносить определённую прибыль. В конечном итоге, это улучшит качество выпускаемой продукции, и приведёт к оптимальному течению послеоперационного периода, минимальному количеству осложнений, прогнозируемым срокам остеоиноеграции установленных имплантатов.

Таким образом, по результатам наших исследований можно с уверенностью утверждать о выраженном положительном воздействии предложенного модифицированного покрытия внутрикостной части дентальных имплантатов на процессы регенерации и остеоинтеграции.