Диссертационная работа

Электронная микроскопия

Глава 5. Сканирующая электронная микроскопия.

В эксперименте на культуре ткани стромальных клеток-предшественников костного мозга, удалось проследить влияния новых видов поверхностной обработки (ионно-плазменного травления, дробеструйной обработки и обработки поверхности титана с помощью микроплазменных разрядов) на остеогенные стромальные клетки-предшественники. Но остался ключевой вопрос о степени адгезии, площади прикрепления и распределения остеогенных клеток на подготовленных поверхностях титана.

В последние три десятилетия достигнуты значительные успехи в развитии сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), которые существенно расширили возможности использования этого метода в морфологии и микробиологии (Уикли Б. 1975). В основу СЭМ положен принцип формирования изображения на экране электронно-лучевой трубки с помощью развёртки, синхронной с развёрткой электронного луча, последовательно облучающего сканируемую поверхность изучаемого объекта. При этом одновременно регистрируется ряд вторичных излучений, что обеспечивает высокую информативность и разрешающую способность метода СЭМ, с помощью которого изучается морфология и структура поверхности различных объектов. Одной из замечательных особенностей СЭМ является и большая глубина резко изображаемого пространства (глубина фокуса), которую можно к тому же усилить путём наклона объектного столика (до 45О) и с помощью динамического фокусирования (Волков О.В., Шахламов В.А. Миронов А.А. 1987).

Рис. № 52 Внешний вид сканирующего электронного микроскопа фирмы «Hitachi».

При использовании традиционных сканирующих электронных микроскопов влажный биологический объект должен быть фиксирован, обезвожен и высушен с помощью методов, щадящих его поверхность, так как он подвергается воздействию глубокого вакуума (10-5мм.рт.ст.) и интенсивной бомбардировке ускоренными электронами. Ускоряющее напряжение для СЭМ обычно выбирается равным 10 - 20 кВ.

При СЭМ в качестве регистрируемого вторичного излучения выбирают, прежде всего, вторичные электроны, то есть, электроны внешних оболочек атомов вещества изучаемого объекта, запыленного металлом. Такие электроны легко фокусируются и могут покинуть изучаемый объект только из тонкого (10 нм) поверхностного слоя вблизи места бомбардировки, что и обеспечивает высокую разрешающую способность СЭМ, которая, однако, меньше, чем для ТЭМ. Предельное разрешение в СЭМ обычно достигает порядка 10 нм при использовании вольфрамового термокатода (что соответствует полезным увеличениям в 50 – 60 тыс. раз) и порядка 5 нм со специальными электронными пушками повышенной яркости. В большинстве случаев для изучения морфологии биологических объектов бывает достаточно увеличений в 5 – 20 тыс. раз.

Ставя перед собой задачу, визуально оценить степень и площадь прикрепления стромальных остеогенных клеток-предшественников к различным поверхностям имеющихся образцов мы прибегли к СЭМ титановых дисков используемых в предыдущем эксперименте на культуре тканей. Данное исследование проводилось в межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биофака МГУ им. М.В.Ломоносова.

После завершения эксперимента на пассированной культуре тканей титановые диски аккуратно извлекали и подвергали специальной обработке для проведения сканирующей электронной микроскопии поверхности. Суть этой обработки заключалась в следующем:

• культуру вместе с титановым диском трижды отмыть раствором Хэнкса при температуре 37ОС.

• далее титановые образцы помещали в раствор, состоящий из 1,6 мл 25 % глютаральдегида, 15 мл. кокодилатного буфера который готовился заранее и хранился при температуре 4ОС, и 3,4 мл дистиллированной воды. В этом растворе титановые диски находились не менее 1 часа в термостате при температуре 37ОС.

• далее осуществлялась проводка, т.е. обезвоживание препарата. Эта манипуляция осуществлялась по следующей схеме:

  • Н2О (дистиллированная)

  • ¼ ацетона + ¾ Н2О

  • ½ ацетона + ½ Н2О

  • ¾ ацетона + ¼ Н2О

  • I ацетон – 100 %

  • II ацетон – 100 %

Каждый этап проводки был длительностью – 15 мин.

После завершения всех подготовительных этапов препараты в течение первого часа подвергались электронной микроскопии поверхности, содержащие на себе фиксированные остеогенные клетки–предшественники костного мозга.

5.1. Результаты сканирования титановых образцов с поверхностью полученной в результате ионно-плазменного травления.

Рис. № 53 Поверхность титанового образца при увеличении 20 мкм без клеточного материала.

Рис. № 54 Поверхность титанового образца при увеличении 5 мкм без клеточного материала.

На рисунках № 53-54 представлены участки поверхности титановых образцов, с различным увеличением, обработанных ионно-плазменным способом без клеточного материала.

Рис. № 55 Поверхность титанового образца с клеточным материалом на поверхности (увеличение 20х3мкм).

Рис. №56 Поверхность титанового образца с клеточным материалом на поверхности (увеличение 20х3мкм).

Рисунки № 55-56. Участки титановых образцов с увеличением 3мкм с расположенными на поверхности фибробластоподобными клетками предшественниками костного мозга. Выросты эктоплазмы повторяют рельеф поверхности.

Рис. № 57 Поверхность титанового образца с клеточным материалом на поверхности (увеличение 20х3мкм).

Рис. № 58 Поверхность титанового образца с клеточным материалом на поверхности (увеличение 10х3мкм).

На рисунках № 57-58 представлены участки поверхности, титановых дисков обработанных ионно-плазменным способом. Отчётливо видны фибробластоподобные остеогенные клеточные структуры «распластанные» на поверхности металла, с выростами эктоплазмы стромальных клеток фиксированных на имеющихся неровностях.

5.2. Результаты сканирования титановых образцов с поверхностью полученной в результате дробеструйной обработки.

Рис. № 59 Поверхность титанового образца при увеличении 50 мкм без клеточного материала.

Рис. № 60 Поверхность титанового образца при увеличении 5 мкм без клеточного материала.

На рисунках № 59-60 представлены участки поверхности титановых образцов, обработанных дробеструйным способом без клеточного материала (увеличение 50 мкм и 5 мкм).

Рис. № 61 Поверхность титанового образца с клеточным материалом на поверхности (увеличение 15х3мкм).

Рис. № 62 Поверхность титанового образца с клеточным материалом на поверхности (увеличение 12х3мкм).

На рисунках № 61-62 представлены титановые диски с подготовленной поверхностью обработанной дробеструйным способом. Определяется несколько фибробластоподобных остеогенных клеток предшественников костного мозга на поверхности металла, с выростами эктоплазмы на имеющихся неровностях.

Рис. № 63 Поверхность титанового образца с клеточным материалом на поверхности (увеличение 40х3мкм).

Рис. № 64 Поверхность титанового образца с клеточным материалом на поверхности (увеличение 20х3мкм).

Рисунок № 63. Под увеличением 3 мкм определяются отдельные фибробластоподобные остеогенные клетки на поверхности металла, с выростами эктоплазмы. Под клеточной структурой визуально прослеживается микрорельеф поверхности. На рисунке № 64, участок поверхности титанового диска с множественными выростами эктоплазмы фибробластоподобных клеток предшественников.

5.3. Результаты сканирования титановых образцов с поверхностью полученной с помощью микроплазменных разрядов.

Рис. № 65 Поверхность титанового образца при увеличении 50 мкм без клеточного материала.

Рис. № 66 Поверхность титанового образца при увеличении 5 мкм без клеточного материала.

На рисунках № 65-66 представлены участки поверхности титановых образцов, обработанных с помощью микроплазменных разрядов без клеточного материала (увеличение 50 мкм и 5 мкм).

Рис. № 67 Поверхность титанового образца с клеточным материалом на поверхности (увеличение 30х3мкм).

Рис. № 68 Поверхность титанового образца с клеточным материалом на поверхности (увеличение10х3мкм).

На рисунках представлены титановые диски с подготовленной поверхностью обработанной с помощью микроплазменных разрядов. Определяется всего две фибробластоподобных остеогенных клетки предшественников костного мозга на поверхности металла. Выросты эктоплазмы повторяют полученный ранее рельеф поверхности.

Рис. № 69 Поверхность титанового образца с клеточным материалом на поверхности (увеличение 40х3мкм).

Рис. № 70 Поверхность титанового образца с клеточным материалом на поверхности (увеличение 15х3мкм).

На рисунках № 69-70 представлены участки поверхности, титановых дисков обработанных с помощью микроплазменных разрядов. Отчётливо видны отдельно расположенные единичные фибробластоподобные остеогенные клеточные структуры «распластанные» на поверхности металла, с выростами эктоплазмы клеток фиксированных на имеющихся неровностях.

5.4. Сравнение площади заполнения клеточным материалом на титановых образцах различных групп обработки поверхности при сканирующей электронной микроскопии.

Для электронного сканирования поверхности были выбраны по 10 титановых образцов из трёх исследуемых групп с различной поверхностной обработкой.

Все полученные изображения, после электронного сканирования титановых образцов с различной поверхностной обработкой и наличием на исследуемом микрорельефе клеточного материала II и III пассажа после проведения эксперимента были подвергнуты специальной обработке с помощью ряда компьютерных программ.

Это было сделано для определения и последующего сравнения соотношения площадей, занятых клетками предшественниками костного мозга в трёх группах исследуемых образцов. Сравнение показателей проводилось как между группами с различной поверхностной обработкой, так и внутри группы с величиной площади свободной от клеточного материала. Для этого использовались:

векторный графический редактор: выделение, заливка области, занятой клетками (на новом слое). Сохранение в формате jpg и psd.

3Д редактор: создание плоскости, пропорциями идентичной файлу jpg , состоящей из 32768 полигонов(128х128х2). Проекция на плоскость файла jpg в качестве текстуры. Преобразование плоскости в Edit Mesh. Выделение полигонов, соответствующих заливке клеток. Вычисление занятой выделением площади (N – количество выделенных полигонов) в процентах = N/32768*100.

В дальнейшем применялось математическое компьютерное моделирование, определение и расчёт площади занимаемых клеточным материалом, определение процентного соотношения по исследуемым группам образцов (Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. 2002).

Рис. № 71 Компьютерное определение площади поверхности титановых образцов.

5.4.1. Результаты сканирования поверхности титановых образцов прошедших ионно-плазменное травление после проведения II и III пассажа клеточной культуры.

Рис. № 72 Образцы титановых пластин прошедшие поверхностную обработку с помощью ионно-плазменного травления с клеточным материалом на поверхности (увеличение 20х3мкм.).

На рисунке № 72 представлены участки поверхностей титановых образцов прошедшие обработку с помощью ионно-плазменного травления. На изображении цветом выделена площадь, занимаемая фибробластоподобными клетками предшественниками костного мозга. Обозначен процент занимаемого объёма, от общей площади поверхности сканируемого участка.

Рис. № 73 Образцы титановых пластин прошедшие поверхностную обработку с помощью ионно-плазменного травления с клеточным материалом на поверхности (увеличение 20х3мкм.).

На рисунке № 73 представлены участки поверхностей титановых образцов прошедшие обработку с помощью ионно-плазменного травления. На изображении цветом выделена площадь, занимаемая фибробластоподобными клетками предшественниками костного мозга. Обозначен процент занимаемого объёма, от общей площади поверхности сканируемого участка.

Рис. № 74 Образцы титановых пластин прошедшие поверхностную обработку с помощью ионно-плазменного травления с клеточным материалом на поверхности (увеличение 30х3мкм.).

На рис. № 74 представлены участки поверхностей титановых образцов прошедшие обработку с помощью ионно-плазменного травления. На изображении цветом выделена площадь, занимаемая фибробластоподобными клетками предшественниками костного мозга. Обозначен процент занимаемого объёма, от общей площади поверхности сканируемого участка.

Оценивая результаты представленные в таблице № 3 можно сделать вывод, что величина площади занимаемой клетками на поверхности титановых образцов прошедших обработку с помощью ионно-плазменного травления равна 73,5% от площади свободной поверхности. Это достоверно больше величины свободной площади титанового диска 26,4%.

5.4.2. Результаты сканирования поверхности титановых образцов прошедших дробеструйную обработку после проведения II и III пассажа клеточной культуры.

Рис. № 75 Образцы титановых пластин прошедшие дробеструйную обработку с клеточным материалом на поверхности (увеличение 40х3мкм.).

На рисунке № 75 изображены участки поверхностей титановых пластин прошедшие дробеструйную обработку. Цветом выделена площадь, занимаемая фибробластоподобными клетками предшественниками костного мозга. Обозначен процент занимаемого объёма, от общей площади поверхности сканируемого участка.

Рис. № 76 Образцы титановых пластин прошедшие дробеструйную обработку с клеточным материалом на поверхности (увеличение 40х3мкм.).

На рисунке № 76 изображены участки поверхностей титановых пластин прошедшие дробеструйную обработку. На изображении цветом выделена площадь, занимаемая клеточным материалом. Обозначен процент занимаемого объёма, от общей площади поверхности сканируемого участка.

Рис. № 77 Образцы титановых пластин прошедшие дробеструйную обработку с клеточным материалом на поверхности (увеличение 40х3мкм.).

На рисунке № 77 представлены участки поверхностей титановых образцов прошедшие дробеструйную обработку. На изображении цветом выделена площадь, занимаемая фибробластоподобными клетками предшественниками костного мозга. Обозначен процент занимаемого объёма, от общей площади поверхности сканируемого участка.

Оценивая результаты таблицы № 4 можно сделать вывод, что величина площади занимаемой клетками на дробеструйно-обработанной поверхности титановых образцов равна 58,5% от общей площади поверхности. Это немногим больше половины величины свободной площади титанового диска 41,5%.

5.4.3. Результаты сканирования поверхности титановых образцов обработанных методом микроплазменных разрядов после проведения II и III пассажа клеточной культуры.

Рис. № 78 Образцы титановых пластин прошедшие поверхностную обработку методом микроплазменных разрядов с клеточным материалом на поверхности (увеличение 30х3мкм.).

На рисунке № 78 представлены участки поверхностей титановых образцов прошедшие обработку методом микроплазменных разрядов. На изображении цветом выделена площадь, занимаемая фибробластоподобными клетками предшественниками костного мозга. Обозначен процент занимаемого объёма, от общей площади поверхности сканируемого участка.

Рис. № 79 Образцы титановых пластин прошедшие поверхностную обработку методом микроплазменных разрядов с клеточным материалом на поверхности (увеличение 10х3мкм.).

На рисунке № 79 представлены участки поверхностей титановых образцов прошедшие обработку методом микроплазменных разрядов. На изображении цветом выделена площадь, занимаемая клеточным материалом. Обозначен процент занимаемого объёма, от общей площади поверхности сканируемого участка.

Рис. № 80 Образцы титановых пластин прошедшие поверхностную обработку методом микроплазменных разрядов с клеточным материалом на поверхности (увеличение 30х2мкм.).

На рисунке № 80 представлены участки поверхностей титановых образцов прошедшие обработку методом микроплазменных разрядов. На изображении цветом выделена площадь, занимаемая фибробластоподобными клетками предшественниками костного мозга. Обозначен процент занимаемого объёма, от общей площади поверхности сканируемого участка.

Анализируя результаты таблицы № 5 можно сделать вывод, что величина площади занимаемой клетками на поверхности титановых образцов прошедших обработку с помощью микроплазменных разрядов равна 23,9% от площади свободной поверхности. Это меньше четверти величины свободной площади титанового диска 72,1%.

Рис. № 81 Диаграмма среднего числа показателей клеточного материала на поверхности титановых образцов с различной обработкой.

Таким образом, подводя итог можно с уверенностью сказать, что сканирующая электронная микроскопия, проведённая на титановых дисках с разной обработкой поверхности, взятых в эксперименте на пассированной культуре, подтвердила наши предположения о хорошей адгезии и достаточно плотной площади размещения остеогенных стромальных фибробластоподобных клеток на поверхности титана. Анализируя полученные результаты, лидером по площади занятой клеточным материалом является метод отработки ионно-плазменным травлением (73,5%) и дробеструйной обработки (58,5%). Значительно меньшую площадь занимает клеточный материал на титановых образцах с поверхностью полученной с помощью микроплазменных разрядов 23,9%.