Диссертационная работа

Цитологические модели

ГЛАВА 4 Экспериментальные исследования по влиянию модифицированных поверхностей на остеогенные стромальные клетки-предшественники костного мозга.

Известно что, особое значение при конструировании дентальных имплантатов придается их поверхности, которая во многом определяет не только прочностные свойства имплантата, но и условия для адсорбции биомолекул и адгезии клеток окружающих тканей. Кроме того, форма и структура поверхности внутрикостной части имплантата существенно влияет на способность к остеоинтеграции.

Для проведения исследований в лаборатории стромальной регуляции иммунитета ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, (руководитель лаборатории д.м.н. профессор Чайлахян Р.К.), была создана экспериментальная модель воздействия самих титановых дисков с разной выраженностью микрорельефа поверхности на остеогенные стромальные клетки. Она позволила выявить зависимость различных видов обработки поверхности титана на развитие и пролиферативную активность остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга.

width="."

Разработанный в лаборатории метод избирательного клонирования в монослойных культурах костного мозга позволил выделить стромальные клетки-предшественники и даже получить потомство отдельных стромальных клеток, обладающих достаточно высоким пролиферативным потенциалом. Благодаря малой концентрации ретикулярных клеток (1-3%), они сильно разобщены друг от друга клетками других типов. При эксплантации в монослойные культуры суспензии клеток костного мозга, через 10-12 дней во флаконах образуются видимые невооруженным глазом колонии фибробластов. К этому сроку некоторые колонии достигают 0.5-1,0 см в диаметре и включают по несколько тысяч клеток. Для культивирования используют обычные синтетические питательные среды (199, Игла, Фишер, ά- MEM) с 20% сыворотки эмбрионов коров (СЭК) без добавления ростостимулирующих факторов. При культивировании костного мозга человека используют те же питательные среды с добавлением 10% СЭК и 10% сыворотки человека АВ (IV).

Первым косвенным свидетельством в пользу клонального происхождения стромальных колоний в культурах кроветворных и лимфоидных клеток была линейная зависимость между числом эксплантированных клеток и количеством вырастающих колоний. Проведенный на различных моделях хромосомный анализ делящихся клеток индивидуальных колоний показал, что все делящиеся клетки принадлежат одному кариотипу. Это свидетельствовало о том, что каждая колония является клеточным клоном и состоит из потомков одной колониеобразующей клетки (Фриденштейн А.Я. и соавт. 1971,1973).

По морфологическим признакам клетки в колониях представляют собой типичные фибробласты. Характерно присутствие в них фибрилл, эргастоплазматического ретикулума и крупного ядрышкового комплекса в ядре. Определение типа клеток - родоначальников колоний имеет принципиальное значение, т.к. устанавливаются критерии, по которым данная категория костномозговых клеток-предшественников отличается от других стромальных элементов.

Гистогенетическая независимость стромальных клеток образующих колонии фибробластов (КОКф) от стволовых кроветворных клеток была подтверждена также методом иммунофлюоресценции на модели гетеротропных трансплантатов, а также в костном мозге радиохимер. Аналогичный вывод был сделан в работе на тех же моделях с использованием цитолитического действия Т-киллеров, а также в цитотоксической реакции с антилинейной сывороткой и комплементом.

Как известно, к адгезивным факторам, обеспечивающим прикрепление клеток к твердому субстрату, относятся, во-первых, двухвалентные катионы Са и Mg. которые элетростатически связывают отрицательно заряженную клеточную поверхность с субстратом. Исследования HoshiK., и соавт. 2001 показали, что стромальные клетки - предшественники кроветворной и лимфоидной ткани обладают высокой адгезивностью к поверхности культуральных сосудов. По скорости адгезии они сравнимы с такими высокоадгезивными клетками, как макрофаги. При изучении адгезивности костномозговых КОКф оказалось, что популяция этих клеток гомогенна по этому признаку: за первые 30 мин. культивирования к субстрату прикрепляется более 60% колониеобразующих клеток, а за 90 мин. - более 90% этих клеток.

Отношение числа выросших колоний к количеству эксплантированных клеток характеризует эффективность колониеобразования (ЭКОф). По эффективности колониеобразования можно определить, сколько КОКф содержится в исследуемой суспензии и. зная какую часть органа, использовали для ее приготовления, вычислить, сколько клоногенных клеток содержится в целом органе.

4.1. Влияние различных поверхностей титана на эффективность колониеобразования остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга.

Влияние новых поверхностей титана на процессы остеоинтеграции происходящие в костной ткани при имплантации, было изучено на модели избирательного клонирования на культурах остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга человека. Данные этих исследований позволят определить влияние нового микрорельефа на пролиферативную активность остеогенных стромальных клеток в области имплантации.

Учитывая, что в настоящее время большинство практикующих врачей-хирургов применяют имплантаты с традиционными методами поверхностной обработки: механической, дробеструйной (пескоструйной), титано-плазменным напылением, нанесением гидрооксилаппатита, нами была выбрана дробеструйная модель обработки имплантата системы «ЛИКо». Она была разработана в Московском Государственном Медико-стоматологическом университете на кафедре факультетской хирургической стоматологии и имплантологии.

Для сравнения обработки поверхности был выбран титан марки ВТ-1-О. Образцы представляли собой титановые диски диаметром 12,0 мм, толщиной 0,5 мм, в центре которых имелось технологическое отверстие диаметром 2,5 мм. Первая группа дисков обработана с помощью классического дробеструйного способа (72 диска), вторая с применением метода ионно-плазменного травления (72 диска), третья поверхность получена путём микроплазменных разрядов (72 диска).

Рис. № 39 Внешний вид титанового диска, обработанный ионно-плазменным методом.

Рис. № 40 Сканирование поверхности титанового диска, обработанный ионно-плазменным методом.

Рис. № 41 Внешний вид титанового диска, обработанный дробеструйным методом.

Рис. № 42 Сканирование поверхности титанового диска, обработанный дробеструйным методом.

Рис. № 43 Внешний вид титанового диска, обработанный методом микроплазменных разрядов.

Рис. № 44 Сканирование поверхности титанового диска, обработанного методом микроплазменных разрядов.

Изучение влияния титановых дисков на эффективность колониеобразования остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга и пролиферативную активность стромальных клеток при развитии штаммов проводили, помещая их в пластиковые 6-ти луночные планшеты с питательной средой, вслед за эксплантацией костномозговых остеогенных стромальных клеток. Титановые диски (по 36 образцов в каждой группе), находились в лунках в течение всего времени культивирования.

Рис. № 45 Внешний вид 6-ти луночного планшета с помещенными в питательную среду титановыми дисками с различным видом поверхностной обработки.

В таблице № 1 представлены результаты исследований по влиянию титановых дисков с различной обработкой поверхности на колониеобразование остеогенных стромальных клеток-предшественников в монослойных культурах. Во 2-ой группе культур (ионно-плазменная обработка поверхности) число выросших колоний было достоверно больше, чем в контрольной группе (21,11  0,36). В 1-ой группе, где в планшете были помещены титановые диски с дробеструйной обработкой поверхности, число выросших колоний (20,22  0,50) было так же достоверно выше (Р < 0,05) контрольных значений.

Если количество выросших колоний фибробластоподобных клеток в контрольной группе образцов принять за 100%, то увеличение прослеживается в двух экспериментальных группах из трёх. В группе с ионно-плазменным травлением 112,5%, с дробеструйной обработкой поверхности 107,7%. В группе с обработкой микроплазменными разрядами не значительное уменьшение 95,9%.

Рис. № 46 Диаграмма среднего числа показателей эффективности колониеобразования в первичных культурах костного мозгаinvitro.

Необходимо отметить, что в 3-й группе, в которой находились титановые диски с поверхностью полученной с помощью микроплазменных разрядов, среднее количество числа колоний было достоверно ниже не только, первых двух, но и контрольной группы (18,0 ± 0,29) и (18,77 ± 0,79) соответственно (рис. 46-48).

Рис. № 47 Колонии остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга с титановым диском, прошедшим ионно-плазменную обработку поверхности.

Рис. № 48 Колонии остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга с титановым диском, обработанным дробеструйным способом.

Рис. № 49 Колонии остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга с поверхностью титановых дисков, полученных путём микроплазменных разрядов.

4.2. Влияние различных поверхностей титана на пролиферативную активность штаммов остеоегнных клеток- предшественников.

В экспериментах с культурами клеток остеогенных стромальных клеток-предшественников II пассажа были использованы диски тех же 3 типов поверхностной обработки (по 36 образцов в каждой группе).

Рис. № 50 Внешний вид 6-ти луночного планшета с помещенными в питательную среду титановыми дисками с различным видом обработки поверхности.

Как и в экспериментах, по изучению влияния титановых дисков с различной поверхностной обработкой на эффективность колониеобразования среднее число выросших клеток было достоверно больше в культурах, в которые находились титановые диски после ионно-плазменной и дробеструйной обработки поверхности (2,01 ± 0,02) и (1,88 ± 0,03) соответственно (таблица № 2). Достоверно меньшее число выросших клеток было в группе с титановыми дисками после обработки поверхности микроплазменными разрядами (1,7 ± 0,22), как по сравнению с первой и второй группами, так и с контрольной группой культур без титановых дисков (1,36 ± 0,07) (Р < 0,05).

Если количество выросших фибробластоподобных клеток в контрольной группе образцов принять за 100%, то увеличение прослеживается во всех экспериментальных группах. В группе с ионно-плазменным травлением 147,8%, с дробеструйной обработкой поверхности 138,2%, в группе с обработкой микроплазменными разрядами 125%.

Рис. № 51 Диаграмма среднего числа показателей пролиферативной активности остеогенных стромальных клеток-предшественников в пассированных культурах invitro

Не столь значительную разницу в увеличении числа клеток в культурах с разным микрорельефом титановых дисков и контрольной группой можно объяснить быстрым (3-4 дня) формированием в них плотного монослоя остеогенных стромальных фибробластов. Дальнейшую пролиферацию остеогенных фибробластов ограничивает развивающееся контактное торможение клеток. В то же время более равномерное развитие культур контрольной группы в первые дни, к 7 дню, возможно, достигло пика пролиферативной активности.

Поверхности титановых дисков полученные с помощью разных способов обработки, помещённые в монослойные культуры, по-разному влияли на остеогенные стромальные клетки-предшественники костного мозга. Результаты, полученные во всех экспериментах с дисками прошедшими ионно-плазменную обработку (1 группа), были достоверно выше контрольных значений, чего нельзя сказать о дисках после обработки микроплазменными разрядами (3 группа). Результаты исследований на культуре тканей с дисками после дробеструйной обработки (2 группа) не значительно отличались от результатов 1-й группы, но были достоверно выше 3-й группы и контроля. Такое различие, на наш взгляд можно объяснить однородностью полученной поверхности дисков с применением ионно-плазменного травления и, как следствие, не оказывает выраженного негативного воздействия на клеточные структуры в культуральных флаконах. Предложенная нами оригинальная технология получения поверхности с помощью ионно-плазменного травления, до недавнего времени была серьёзной технической проблемой, но сейчас дало возможность получить классическую по однородности форму микрорельефа титанового диска. Полученные результаты, безусловно, найдут своё отражение в производстве имплантатов и в клиническом их применении.

Обобщая полученные результаты можно с уверенностью сказать, что предложенные нами различные варианты обработки поверхности титановых дисков, за исключением поверхности полученной с помощью микроплазменных разрядов не оказывают угнетающего действие на рост и развитие остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга.