Публикации

Изучение влияния физических методов обработки поверхности титана на рост колоний клеток-предшественников костной ткани

1. Введение.

В течение всей второй половины 20-го века в мировой научной и практической медицине велся поиск биоинертного материала для применения в протезировании костных тканей при хирургическом лечении травм и дефектов костей человека [1]. Особенно актуальны такие поиски для стоматологии в силу широкого распространения среди людей заболеваний зубов и челюстных костей [2]. В результате длительного научного поиска исследователи пришли к наиболее оптимальному металлическому сплаву на основе титана: титановый сплав ВТ-1-0 (российский стандарт), Grade-4" (стандарт США) и европейский стандарт. Решающей особенностью этого выбора этого сплава является свойство его при контакте с воздушной средой покрываться тонкой (~ 10 нм) оксидной пленкой – рутилом (Ti2O4), который проявляет уникальную способность практически не вступать в химические реакции с биологическим средами [3]. В частности это свойство биоинертности оказалось очень важным для применения в стоматологии для изготовления имплантантов, используемых в качестве протезов корней зубов человека.

Кроме свойства инертности, важно, чтобы костная ткань эффективно фиксировала титановый имплантант путем остеоинтеграции – формирования устойчивого биомеханического контакта между поверхностью титанового сплава и костной тканью. Качество (прочность фиксации имплантанта костной тканью) такого контакта зависит от свойств поверхности имплантанта. Для модификации поверхности имплантанта в настоящее время применяются различные методы. Широко распространенными методами подготовки поверхности имплантантов к контакту с костной тканью являются следующие: метод дробеструйной обработки, метод нанесения гидроксиапатитовых покрытий и метод модифицированного электретного покрытия. Все эти работающие методы несущественно изменяют топологию поверхности имплантанта, в то время как микрорельеф его поверхности и площадь контакта с костной тканью определяют прочностные характеристики фиксации имплантанта в кости и срок службы протеза. В настоящее время активно разрабатывается новый метод микроплазменного формирования прочного микрорельефа на поверхности титана. Этот плазменный метод позволяет получать прочный микрорельеф с высотой выступов и горизонтальным масштабом рельефа от 1 до 10 мкм, соизмеримыми с характерными размерами клеток костной ткани. При этом эффективная площадь контакта модифицированной поверхности импланта и костной ткани может возрастать в несколько раз и существенно улучшить устойчивость имплантанта в костной ткани.

Цель наших исследований состояла в том, чтобы изучить влияние физических методов обработки поверхности титана на рост колоний клеток-предшественников костной ткани и оценить митотическую активность клеток-предшественников косного мозга на поверхности образцов титана

2. Условия экспериментов и методы исследования.

Особое значение при конструировании дентальных имплантатов придается их поверхности, которая во многом определяет не только прочностные свойства имплантата, но и условия для адсорбции биомолекул и адгезии клеток окружающих имплантат тканей. Кроме того, форма и структура поверхности внутрикостной части имплантата существенно влияют на способность к согласованному взаимодействию биомеханической системы «ортопедическаяконструкция, - имплантат - костная ткань».

Поэтому основными задачами производства дентальных имплантатов являются:

Увеличение индекса биофункциональности материала имплантата.

Создание микроструктуры поверхностей имплантата, адекватной типу окружающих тканей.

Создание макроконструкции имплантата, имеющей достаточную удельную площадь поверхности для адекватного биомеханического взаимодействия с костной тканью.

2.1. Методика нанесения дробеструйного покрытия на поверхность титановых дисков.

Текстуру или определенную, имеющую регулярный рисунок, шероховатость на поверхности имплантата можно создать при помощи так называемой рельефной формовки или методом наката. Микрорельеф поверхности имплантата при этом образуется за счет местных поверхностных деформаций материала. Получаемые таким образом незначительные углубления и выступы придают определенную регулярную шероховатость поверхности внутрикостной части имплантата.

Второй способ - обработка поверхности внутрикостной части имплантата абразивными материалами под давлением (пескоструйная обработка). В качестве абразивного материала обычно используются порошки алюмо- или титаноксидной керамики. Оптимальным считается создание микрорельефа при обработке частицами диаметром 75 мкм.

Для получения необходимой поверхности на титановых образцах нами применялся второй способ – абразивная обработка с использованием керамического порошка. Данная обработка была проведена на предприятии ЗАО «КОНМЕТ» специализирующееся на производстве медицинских устройств, инструментов и имплантатов

2.2. Методика нанесения покрытия на поверхность титановых дисков с помощью ионно-плазменного травления.

Все исследования связанные с отработкой методик и созданием модифицированной поверхности титановых образцов были выполнены в Санкт-Петербургском государственном электротехническом университете «ЛЭТИ». Под руководством д.т.н. профессора, заслуженного деятеля науки и техники, лауреата Государственной премии РФ, зав. кафедрой электронных приборов и устройств Быстрова Ю.А.

Разработан принципиально новый метод создания микрорельефа на поверхности титановых образцов, основанный на технологии ионного травления.

Поверхность титанового образца обрабатывается концентрированными потоками энергии (Ионным Пучком). Метод реализован на установке УВНИПА 1-002. Модернизированный источников ионов типа «Радикал» позволяет создать на поверхности титана однородный микрорельеф с размером шероховатостей порядка 1,5-2 мкм (I разр. =1 А, исмещ.=1>5 кВ, t = 120 мин, Р раб = 4,5*10 "2 Па, рабочий газ - аргон, реактивный газ - кислород). Модернизированная установка УВНИПА 1-002 предназначена для травления металлов и износостойких покрытий.

В данной системе травления на посадочные места катодных блоков дуговых испарителей установлены источники электронов, которые представляют собой охлаждаемые водой цилиндры с соотношением внутреннего диаметра к длине 1:3. Вокруг каждого источника создается внешнее магнитное поле с помощью электромагнитных катушек, размещенных на анодных блоках дуговых испарителей. Катушки размещаются таким образом, чтобы максимальная напряженность магнитного поля приходилась на среднюю часть источников электронов. Магнитное поле имеет арочную конфигурацию, что обеспечивает формирование магнитной ловушки для электронов в области источника электронов. Источники электронов запитываются от блока питания, обеспечивающего выходное напряжение Uвых = - 1,5 кВ при общем токе Iобщ.=1А. При рабочем давлении р =1Па источник питания обеспечивает зажигание тлеющего разряда. Дополнительные фокусирующие катушки, направляют поток электронов к центру вакуумной камеры и позволяют частично его расфокусировать. На вращающийся барабан с обрабатываемыми изделиями подается напряжение смещения 11см = - 1 кВ. В области барабана с изделиями развивается мощный пучково-плазменный разряд, подпитываемый двумя источниками электронов. Из разряда ионы аргона с энергией 1 кэВ попадают под разными углами на поверхность обрабатываемых изделий и производят её травление.

2.3. Методика нанесения покрытия на поверхность титановых дисков с помощью микроплазменных разрядов.

Микроплазменные разряды, возбуждаемые плазмой на различных металлах, изучались давно. Учеными из Англии, Германии и Чехии исследовались микроплазменные разряды (униполярные дуги), возбуждаемые на тугоплавких металлах и электропроводящем графите при их контакте с горячей плазмой, удерживаемой в установке типа токамак. Российскими учеными была показана возможность возбуждения микроплазменных разрядов на поверхности металлов в плазме, создаваемой коротким импульсом (длительностью 10 микросекунд) и мощного (мощность до 1МВт) сверхвысокочастотного излучения. В работе, выполненной совместно российскими и немецкими учеными в 1982 году, были получены уникальные результаты по возбуждению микроплазменных разрядов на поверхности металлов при их взаимодействии с потоком плазмы, создаваемым импульсным электрическим разрядом с энергией менее 1 Дж.

2.4.Выделение и размножение остеогенных стромальных клеток–предшественников костного мозга в монослойных культурах.

Предложенные и разработанные новые виды рельефа внутрикостной части имплантата требовали изучения степени колониеобразования и пролиферативной активности на этих поверхностях остеогенных клеток-предшественников.

Изучение влияния модифицированного покрытия на остеогенные клетки-предшественники, принимающие активное участие в процессе остеоинтеграции (остеорепарации) в области установленных имплантатов было проведено на модели избирательного клонирования остеогенных стромальных клеток-предшественников в лаборатории стромальной регуляции иммунитета ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (руководитель лаборатории д.м.н. профессор Чайлахян Р.К.). Разработанная в лаборатории экспериментальная модель позволила впервые выявить в кроветворных и лимфоидных органах человека и млекопитающих новую категорию клеток, а именно, клоногенные стромальные клетки - предшественники.

При эксплантации взвеси клеток кроветворных или лимфойдных органов в монослойные культуры на 10-12 день в них вырастают видимые невооружённым глазом дискретные колонии фибробластов. После обработки трепсином они легко снимаются с пластика и поддаются многократному пассированию, образуя диплоидные штаммы стромальных клеток-предшественников.

Реакцию остеогенных клеток-предшественников на модифицированное покрытие на поверхности металлических сплавов изучали как на первичных культурах, определяя эффективность колониеобразования, т.е. отношение числа вырастающих колоний к стандартному числу эксплантированных клеток, так и на диплоидных штаммах этих клеток, исследуя влияние созданного микрорельефа на поверхности сплава на пролиферативную активность остеогенных клеток–предшественников в культурах.

Эксперименты проведены на 30 крысах «Wistar» самцах массой 80-100 г, полученных из питомника экспериментальных животных РАМН «Крюково».

2.5. Получение эксплантационного материала и приготовление суспензий.

Крыс усыпляли эфиром. С соблюдением правил асептики, через разрез на задней части бедра выделяли бедренные и большеберцовые кости. Эпифизы костей обрезали и шприцом выдували костный мозг во флакон с питательной средой. Фрагменты костного мозга пропускали через шприц с последовательно уменьшающимся диаметром игл, при минимальном давлении в нём, до получения гомогенной взвеси клеток. Взвесь дважды отмывали центрифугированием при 4ОС (400g), осадок ресуспендировали в свежей питательной среде, фильтровали через 4-х слойный капроновый фильтр и подсчитывали число клеток к камере Горяева.

Жизнеспособность клеток в суспензиях определяли по окраске 0,1% раствором трипанового синего. Каплю красителя добавляли к капле суспензии, тщательно перемешивали, заполняли камеру Горяева, и черед 1-2 минуты производили подсчёт живых и мёртвых клеток.

Эксплантация клеток. Для определения эффективности колониеобразования стромальных клеток-предшественников одинаковое количество костномозговых клеток исследуемой суспензии помещали в культуральные 6–ти луночные планшеты с площадью 9,6 см.2 каждый, с 4 мл питательной среды. Плотность эксплантации составляла 3,6х104 клеток/см.2, то есть в каждую лунку засевали по 3,5х105 клеток костного мозга крыс.

Для получения штаммов стромальных клеток-предшественников 3х106 клеток костного мозга эксплантировали во флаконы площадью дна 75 см2 . На 10-14 день культивирования, когда колонии стромальных фибробластов были полностью сформированы проводили I пассаж.

Культуральная среда состояла из 80% среды - МЕМ, 20% сыворотки эмбрионов коров, и антибиотиков - 100 ед. пенициллина и 100 мг стрептомицина на 1мл. среды. Культивирование проводили в СО2 инкубаторе при 37ОС.

Пассирование клеток. Первичные культуры, выращенные во флаконах, дважды отмывали от сыворотки физиологическим раствором. Затем в планшеты добавляли 2-3 мл. 0,25% раствора трипсина, которым обрабатывали культуры в течение 3-5 мин, затем флаконы переворачивали и в таком виде помещали в термостат при 37ОС. Через 15-20 минут трипсин сливали, в культуральные флаконы добавляли, свежую питательную среду и несколько раз встряхивали их. Не открепившиеся клетки снимали пипетированием. Подсчёт числа снятых клеток производили в камере Горяева. Необходимое количество клеток переносили во флаконы с большей площадью дна. Повторные пассажи проводили по этой же методике по достижении полного монослоя клеток в культурах. Питательная среда в пассируемых культурах состояла из 30% кондиционированной среды из под культур, и 70% свежей полной питательной среды.

Для изучения действия модифицированной поверхности на пролиферативную активность штаммов остеогенных клеток-предшественников в 6-ти луночные планшеты помещали титановые диски, с разной поверхностной обработкой, и засевали одинаковое количество пассированных клеток. Культивирование проводили в течение 5-7 дней до формирования плотного монослоя клеток. По описанной выше методике клетки снимали с пластика и производили подсчёт в камере Горяева.

Фиксация, окраска и подсчёт колоний. Перед фиксацией культуральную среду из планшетов сливали, планшеты несколько раз промывали физиологическим раствором и на 30 мин. заливали 80% этанолом. Фиксированные культуры окрашивали по Гимза. Число выросших колоний подсчитывали под бинокулярной лупой, учитывая при этом все колонии состоящие из 50 и более остеогенных фибробластов

2.6. Влияние титановых дисков с различной обработкой поверхности на стромальные клетки - предшественники костного мозга в культуре тканей invitro.

Влияние модифицированной поверхности на остеогенные клетки участвующие в процессе остеоинтеграции, проходящие в костной ткани при имплантации, изучали на модели избирательного клонирования остеогенных стромальных клеток-предшественников в первичных монослойных культурах костного мозга и штаммах остеогенных стромальных клеток.

Для сравнения обработки поверхности был выбран титан марки ВТ-1-О. Образцы представляли собой титановые диски диаметром 12,0 мм., толщиной 0,5 мм, в центре которых имелось технологическое отверстие диаметром 2,5 мм. Первая группа дисков была обработана дробеструйным способом, вторая группа - ионно-плазменным, а третья с помощью микроплазменных разрядов. После необходимой подготовки все диски были подвергнуты стерилизации.

В 6-ти луночные планшеты поместили титановые диски, обработанные различными способами. В каждую лунку засевали 3х105 костномозговых клеток в 4 мл полной культуральной среды. По числу выросших колоний при равном количестве клеток эксплантированных в лунку определяли влияние помещённых в культуру дисков на эффективность колониеобразования. Влияние титановых дисков с разной поверхностной обработкой, на пролиферативную активность остеогенных клеток-предшественников изучали, засевая лунки с помещёнными в них дисками, одинаковым количеством остеогенных стромальных клеток-предшественников II и III пассажа. В каждую лунку засевали по 3х104 клеток в 4 мл. культуральной среды. На 4-ый день культивирования, когда в лунках формировался плотный монослой клеток, культивирование прекращали. Культуры промывали и после обработки 0,25% раствором трепсина снимали с пластика. В камере Горяева подсчитывали общее число клеток, выращенных в каждой лунке.

В каждой серии опытов на каждый вид испытуемых дисков засевали по три 6-ти луночных планшета.

I - группа планшетов с дробеструйно-обработанными титановыми дисками.

II - группа планшетов с титановыми дисками обработанными ионно-плазменным способом.

III – группа планшетов с титановыми дисками обработанными с помощью микроплазменных разрядов.

IV - контрольная группа, без титановых дисков, которую составляли планшеты с тем же числом эксплантированных клеток.

2.7. Проведение сканирующей электронной микроскопии.

Проведение сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) позволило определить рельеф поверхности, её выраженность, агрессивность неровностей и чистоту. При применении электретного покрытия (СЭМ) позволила определить толщину, однородность полученного покрытия, поглощение нанесённым покрытием возможной контаминации поверхности образцов.

Данное исследование проводилось в межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биофака МГУ им. М.В.Ломоносова.

Для определения степени и площади адгезии культуры тканей остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга на поверхности исследуемых титановых образцов с разным покрытием, было проведено электронное сканирование исследуемых поверхностей.

Электронная микроскопия позволила определить форму и количество клеток, увидеть степень прикрепления клеток к поверхности титановых дисков с разной обработкой поверхности.

Подготовка материалов к электронному сканирующему микрокопированию:

Культуру ткани на титановых дисках перед фиксацией трижды отмывали раствором Хэнкса при температуре 37О С.

После чего готовили специальный раствор, для культуры состоящий из: (1,6 мл 25 % глютаральдегида, 15 мл какодилата Na (0,2 Моль), 3,4 мл Н2О) в котором, не менее 1 часа находились титановые диски в условиях термостата при 37О С.

Далее осуществлялась проводка (обезвоживание) состоящая из несколько этапов, с применением чистого ацетона с увеличивающейся, до максимальной концентрации. Подготовленные препараты подвергались электронному сканированию в течение 1 часа.

Полученный цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики с вычислением средних арифметических величин (М), среднеквадратичное отклонение и среднеквадратичной (стандартной) ошибки (m) [5].

Критерий достоверности оценивали по таблице Стьюдента. Статистически достоверными считали величины, которым в таблице соответствовали значения p < 0,05, p < 0,01 значимыми считали вероятности большими 95%, 99%.

Для расчётов и оформления работы использовали персональный компьютер с операционной системой Windows XP, прикладные программы MS Word, MS Excel.

В эксперименте на культуре ткани стромальных клеток-предшественников костного мозга, удалось проследить влияния новых видов поверхностной обработки (ионно-плазменного травления, дробеструйной обработки и обработки поверхности титана с помощью микроплазменных разрядов) на остеогенные стромальные клетки-предшественники. Но остался ключевой вопрос о степени адгезии, площади прикрепления и распределения остеогенных клеток на подготовленных поверхностях титана.

В последние три десятилетия достигнуты успехи в развитии сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), которые существенно расширили возможности использования этого метода в морфологии и микробиологии. [13, 88].В основу СЭМ положен принцип формирования изображения на экране электронно-лучевой трубки с помощью развёртки, синхронной с развёрткой электронного луча, последовательно облучающего сканируемую поверхность изучаемого объекта. При этом одновременно регистрируется ряд вторичных излучений, что обеспечивает высокую информативность и разрешающую способность метода СЭМ, с помощью которого изучается морфология и структура поверхности различных объектов. Одной из замечательных особенностей СЭМ является и большая глубина резко изображаемого пространства (глубина фокуса), которую можно к тому же усилить путём наклона объектного столика (до 45О) и с помощью динамического фокусирования.

При использовании традиционных сканирующих электронных микроскопов влажный биологический объект должен быть фиксирован, обезвожен и высушен с помощью методов, щадящих его поверхность, так как он подвергается воздействию глубокого вакуума (10-5 мм. рт. ст.) и интенсивной бомбардировке ускоренными электронами. Ускоряющее напряжение для СЭМ обычно выбирается равным 10 кВ - 20 кВ.

При СЭМ в качестве регистрируемого вторичного излучения выбирают, прежде всего, вторичные электроны, то есть, электроны внешних оболочек атомов вещества изучаемого объекта, запыленного металлом. Такие электроны легко фокусируются и могут покинуть изучаемый объект только из тонкого (10 нм) поверхностного слоя вблизи места бомбардировки, что и обеспечивает высокую разрешающую способность СЭМ, которая, однако, меньше, чем для ТЭМ. Предельное разрешение в СЭМ обычно достигает порядка 10 нм при использовании вольфрамового термокатода (что соответствует полезным увеличениям в 50 – 60 тыс. раз) и порядка 5 нм со специальными электронными пушками повышенной яркости. В большинстве случаев для изучения морфологии биологических объектов бывает достаточно увеличений в 5 – 20 тыс. раз.

Ставя перед собой задачу, визуально оценить степень и площадь прикрепления стромальных остеогенных клеток-предшественников к различным поверхностям имеющихся образцов мы прибегли к СЭМ титановых дисков используемых в предыдущем эксперименте на культуре тканей. Данное исследование проводилось в межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биофака МГУ им. М.В.Ломоносова.

После завершения эксперимента на пассированной культуре тканей титановые диски аккуратно извлекали и подвергали специальной обработке для проведения сканирующей электронной микроскопии поверхности. Суть этой обработки заключалась в следующем:

1. культуру вместе с титановым диском трижды отмыть раствором Хэнкса при температуре 37ОС.

2. далее титановые образцы помещали в раствор, состоящий из 1,6 мл 25 % глютаральдегида, 15 мл. кокодилатного буфера который готовился заранее и хранился при температуре 4ОС, и 3,4 мл дистиллированной воды. В этом растворе титановые диски находились не менее 1 часа в термостате при температуре 37ОС.

3. далее осуществлялась проводка, т.е. обезвоживание препарата. Эта манипуляция осуществлялась по следующей схеме:

   1. Н2О (дистиллированная)

   2. ¼ ацетона + ¾ Н2О

   3. ½ ацетона + ½ Н2О

   4. ¾ ацетона + ¼ Н2О

   5. I ацетон – 100 %

   6. II ацетон – 100 %

Каждый этап проводки был длительностью – 15 мин.

После завершения всех подготовительных этапов препараты в течение первого часа подвергались электронной микроскопии поверхности, содержащие на себе фиксированные остеогенные клетки–предшественники костного мозга.

3. Результаты исследований и их обсуждение.

3.1. Приводятся фотографии (М.Е. Коныжев) металлических образцов до и после обработки ионным пучком, микроплазменными разрядами, дробеструйным методом.

3.2. Что делали с обработанными образцами: по методике (см. выше) обраб.

Образцы помещались в среду с клетками (монослой) и в инкубаторе выдерживались. В каждую лунку засевали по 3х104 клеток в 4 мл. культуральной среды. На 4-ый день культивирования, когда в лунках формировался плотный монослой клеток, культивирование прекращали.

Далее осуществляли проводку культуры образовавшихся новых клеток и проводили наблюдение в СЭМ. Представляются фотографии СЭМ образцов с образовавшими ся новыми культурами клеток. Делается словесное описание того, что видно на этих фото, обратить внимание на самое главное – возникновение контакта "живого-неживого"(!!), проявляющегося в морфологии клеток: формирование отростков клеток, ориентированных соответственно топологии микрорельефа.

1.Видно, что на обработанных различными методами образцах возникают отростки клеток, фиксирующихся на выступах поверхности, и обходящих углубления поверхности.

2. Важно отметить, что существует режим обработки (микроплазменной), при которых на поверхности образцов из сплава ВТ-1-0 при "определенной" обработки возникают устойчивые условия адгезии жизнеспособных живых клеток – остеогенных клеток предшественников.

Представление данных таблиц (№1 и №2) и их интерпретация.

Таблица №1. Статистические данные роста колоний клеток красного костного мозга на поверхности образцов титанового сплава, обработанных различными методами.

Таблица №2. Статистические данные роста остеогенных клеток на поверхности образцов титанового сплава, обработанных различными методами.

3. В лунках в присутствие обработанных различными методами 27 образцов культуры клеток красного костного мозга развиваются также хорошо как и в отсутствии металлических образцов. Это указывает на то, что все примененные виды обработок титана не приводят к подавлению митотической функции клеток, - т.е. клетки развиваются на поверхности металлических сплавов титана, без признаков токсической супресии.

4. Все виды обработки поверхности металлических сплавов титана в пределах статистического разброса дают одинаковую скорость роста новых клеток и колоний клеток на их поверхности при одинаковых условиях среды выращивания.

4. Выводы.

1. Экспериментально установлено, что на обработанных различными методами образцах возникают отростки клеток, фиксирующихся на выступах поверхности, и обходящих углубления поверхности.

2. Экспериментально показано, что существует режим обработки (микроплазменной), при которых на поверхности образцов из сплава ВТ-1-0 при "определенной" обработки возникают устойчивые условия адгезии жизнеспособных живых клеток – остеогенных клеток предшественников.

3. Экспериментально установлено, что в присутствие обработанных различными методами 27 образцов культуры клеток красного костного мозга развиваются также хорошо как и в отсутствии металлических образцов. Это указывает на то, что все примененные виды обработок титана не приводят к подавлению митотической функции клеток, - т.е. клетки развиваются на поверхности металлических сплавов титана, без признаков токсической супресии.

4. Установлено, что механический, ионный и микроплазменный виды обработки поверхности металлических сплавов титана демонстрируют высокую скорость роста новых клеток и колоний клеток на их поверхности при одинаковых условиях среды выращивания.